喹噁啉類藥物是一類化學合成類的抗菌促生長劑，它們(men) 的基本結構是喹噁啉-1,4-二氧化物，即喹噁啉環。主要包括喹乙醇、卡巴氧、喹喔啉、喹賽多、喹多辛、西諾喹多、德那資多（肼多司）、乙酰甲喹和喹烯酮等藥物。研究表明，喹噁啉類藥物對DNA致突變、致損傷(shang) ，破壞細胞抗氧化作用係統，可以引起細胞自由基的產(chan) 生，導致細胞DNA發生氧化性損傷(shang) ，還會(hui) 引起細胞周期阻滯和細胞凋亡。傳(chuan) 統喹噁啉類藥物喹乙醇和卡巴氧，由於(yu) 其對人體(ti) 危害最大，世界各國和國際組織對這兩(liang) 種獸(shou) 藥製定了嚴(yan) 格的殘留*規定。歐盟1998年發文禁止喹乙醇和卡巴氧在食品動物生產(chan) 中作為(wei) 促生長添加劑使用。2020年我國生效實施的GB 31650-2019《食品安全/國家標準食品中獸(shou) 藥最大殘留*》中規定了豬肌肉和豬肝髒組織中喹乙醇殘留標誌物的最大殘留*。同年我國農(nong) 業(ye) 農(nong) 村部公告第250號規定卡巴氧及其鹽、酯為(wei) 食品動物中禁止使用的藥品。但是，這些藥物在生產(chan) 實踐中被大量地非法使用或濫用，其殘留對消費者健康造成了巨大的潛在威脅。喹乙醇和卡巴氧進入動物體(ti) 內(nei) 後，能夠在短時間內(nei) 代謝成十多種產(chan) 物，研究表明，3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）是喹乙醇在動物體(ti) 內(nei) 代謝後的主要產(chan) 物，喹噁啉-2-羧酸（QCA）是卡巴氧在動物體(ti) 內(nei) 代謝後的主要產(chan) 物，且該產(chan) 物在動物體(ti) 內(nei) 滯留時間較長，因其含量與(yu) 總殘留關(guan) 係穩定，所以將MQCA定為(wei) 喹乙醇在動物體(ti) 內(nei) 代謝的殘留標示物，將QCA定為(wei) 卡巴氧在動物體(ti) 內(nei) 代謝的殘留標示物。

本文闡述了如何將卡巴氧、喹乙醇及代謝物從(cong) 樣品基質中分離提取出來，並經過淨化後，轉化成液質聯用儀(yi) 可以檢測的形式。以提取、淨化為(wei) 重點，依據國標GB/T 20746-2006，為(wei) 檢測人員和相關(guan) 領域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：卡巴氧、脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸（QCA）、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）

應用範圍：牛、豬肝髒和肌肉

液相色譜-串聯質譜法

方法原理：

卡巴氧：用乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液提取肌肉和肝髒組織中的卡巴氧，提取液經正己烷脫脂後，旋轉蒸發至幹，殘渣用甲酸（0.1 %）+甲醇（19+1）溶液溶解。樣液供液質測定，內標法定量。

脫氧卡巴氧、QCA、MQCA：用甲酸溶液消化試樣，使組織中天然存在的酶失活，然後加入蛋白酶水解，鹽酸酸化，離心過濾後，過Oasis MAX固相萃取柱或相當者淨化。先用二氯甲烷洗脫脫氧卡巴氧，再用2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脫QCA和MQCA，氮氣吹幹洗脫液，殘渣用甲酸+甲醇（19+1）溶液溶解，樣液供液質測定，內標法定量。

前處理儀(yi) 器：固相萃取裝置；氮氣濃縮儀(yi) ；液體(ti) 混勻器；分析天平（感量0.1 mg和0.01 g）；真空泵；均質器；移液器（10 μL～100 μL和100 μL～1000 μL）；聚丙烯離心管（50 mL具塞）；pH計（測量精度±0.02 pH單位）；低溫離心機（可製冷到4 ℃）；玻璃離心管（15 mL）。

檢測儀(yi) 器：HPLC-MS/MS+ESI源

試樣製備與(yu) 保存

將牛、豬肝髒和肌肉組織樣品充分攪碎，均質，分出0.5 kg作為(wei) 試樣，置於(yu) 清潔樣品容器中，密封，並做上標記。將製備好的試樣於(yu) -18 ℃以下保存。

1. 卡巴氧的前處理步驟

稱取5 g試樣（精/確至0.01 g），置於(yu) 50 mL聚丙烯離心管中，加入5 g中性氧化鋁，加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，於(yu) 液體(ti) 混勻器上充分混合5 min，以5000 r/min離心5 min，將上清液移取至另一幹淨的50 mL離心管，加入10 mL正己烷到管中，振蕩2 min，以5000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，將下層清液轉移至150 mL雞心瓶中。加入25 mL乙腈+乙酸乙酯（1+1）溶液，重複提取一次，正己烷除脂後合並兩(liang) 次提取液於(yu) 同一雞心瓶中，加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d₄（QCA-d₄）標準溶液，使其濃度為(wei) 2.0 ng/g，40 ℃水浴減壓旋轉蒸發至幹。準確加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解殘渣，過0.2 μm濾膜後，供液質測定。

2. 脫氧卡巴氧、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的前處理步驟

稱取5 g試樣（精/確至0.01 g），置於(yu) 50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 0.6 %甲酸溶液，混勻後，置於(yu) （47±3）℃振蕩水浴中振搖1 h；先加入3 mL1.0 mol/L Tris溶液混勻，再加入0.3 mL 0.01 g/mL蛋白酶水溶液，充分混勻後，置於(yu) （47±3）℃振蕩水浴中酶解16 h～18 h。加入20 mL 0.3 mol/L鹽酸溶液，振蕩5 min，在10 ℃以5000 r/min離心15 min，上清液過濾。將濾液移入Oasis MAX固相萃取柱（3 mL甲醇和3 mL水活化）中，待樣液全部流出後，用30 mL 0.05 mol/L乙酸鈉-甲醇（19+1）溶液淋洗固相萃取柱，真空抽幹15 min。在一支幹淨的玻璃管內(nei) 加入一定量的喹噁啉-2-羧酸-d₄（QCA-d₄）標準溶液，使其濃度為(wei) 2.0 ng/g，再用4×3 mL二氯甲烷將脫氧卡巴氧洗脫至管內(nei) ，在45 ℃用氮氣濃縮儀(yi) 吹幹。固相萃取柱再用3×3 mL甲醇、3 mL水、3×3 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和2×3 mL甲醇-水（1+4）溶液分別淋洗，真空抽幹15 min，然後用2 mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱，棄去全部淋出液，最後用3 mL 2 %甲酸乙酸乙酯溶液洗脫喹噁啉-2-羧酸（QCA）和3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）到上述吹幹的試管中，在45 ℃用氮氣濃縮儀(yi) 吹幹。準確加入1.0 mL 0.1 %甲酸-甲醇（19+1）溶液溶解殘渣，過0.2 μm濾膜後，供液質測定。

1.標準物質分別用甲醇配製成100 mg/L的標準儲備液，其中卡巴氧用二甲基甲酰胺配成100 mg/L的標準儲備液，在-18 ℃保存，可使用1年。

2.本方法使用了喹噁啉-2-羧酸-d4（QCA-d₄）同位素內標進行回收率的校正，也可以配合使用各個化合物相對應的同位素內標。

3.本方法各個化合物的提取淨化方法不同，原藥用乙腈+乙酸乙酯直接提取，代謝物需要酶解後過SPE小柱淨化，根據檢測需要選擇方法，具體方法見流程圖。

4.MAX固相萃取柱用於(yu) 酸性化合物的淨化，過程是“堿上樣、酸洗脫”。淋洗後一定抽幹小柱，防止水相進入洗脫液。

5.氮氣濃縮過程中，吹至近幹潮濕狀態，定容後采取渦旋加超聲的方式複溶，可以提高回收率。

6.該方法化合物檢出限為(wei) 0.5 μg/kg，內(nei) 標添加量為(wei) 2.0 μg/kg。

參考文獻

圖1 卡巴氧殘留量測定的前處理流程圖

圖2 脫氧卡巴氧殘留量測定的前處理流程圖

圖3 QCA和MQCA殘留量測定的前處理流程圖