動物源食品中硝基咪唑殘留量測定的前處理方法

硝基咪唑的危害及檢測目的

硝基咪唑類藥物（nitroimidazole,NMZs）是一類具有抗原蟲感染和抗厭氧菌的硝基雜環類抗菌藥物，其具有抗菌和抗原蟲作用。近年來作為(wei) 飼料添加劑廣泛應用於(yu) 畜牧業(ye) 生產(chan) 中，同時也是一種生長促進劑，以促進畜禽的生長及改善飼料的轉換率。由於(yu) 這類化合物含有的硝基雜環類物質具有潛在致癌、致畸和致突變作用，因此歐美等發達國家已禁止在食源性動物中使用硝基咪唑類藥物。我國也對硝基咪唑類藥物進行了嚴(yan) 格的限製，2020年生效實施的GB 31650-2019《食品安quan國家標準 食品中獸(shou) 藥大殘留*》中僅(jin) 規定了甲硝唑和地美硝唑兩(liang) 種物質允許作治療使用，但不得在動物性食品中檢出；同年農(nong) 業(ye) 農(nong) 村部公告第250號，將洛硝達唑、替硝唑列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》中。

本文闡述了如何將硝基咪唑類化合物從(cong) 樣品基質中分離提取出來，並經過淨化後，轉化成液質聯用儀(yi) 可以檢測的形式。以提取、淨化為(wei) 重點，依據國標GB/T 21318-2007，為(wei) 檢測人員和相關(guan) 領域研究人員提供一定的參考。

檢測項目：硝基咪唑類原藥及代謝產(chan) 物

應用範圍：豬肉/雞肉/牛肉/豬肝/雞肝/牛肝/豬腎/牛腎/魚肉/奶粉/蜂蜜

液相色譜-質譜/質譜法

方法原理：樣品中殘留的8種硝基咪唑、2種代謝物用甲醇-丙酮均質或超聲波提取，經乙酸乙酯液液分配，以凝膠色譜（GPC）淨化，再經固相萃取（SPE）淨化，采用液相色譜/串聯質譜確證，外標法定量測定。

前處理儀(yi) 器：

凝膠色譜儀(yi) （配有餾份收集濃縮器）；組織搗碎機；均質器；超聲波發生器；旋轉蒸發器；高速離心機；氮吹儀(yi) ；固相萃取裝置；具塞錐形瓶（250 mL）；分液漏鬥（250 mL）；濃縮瓶（50 mL、250 mL）。

檢測儀(yi) 器：LC-MS/MS+ESI源

前處理方法

1.提取

肌肉組織、髒器組織樣品及水產(chan) 品

準確稱取約20 g樣品（jingqque至0.1 g）於(yu) 250 mL具塞錐形瓶中，加入10 g矽藻土（80目～120目）與(yu) 樣品充分混勻，再依次加入5 mL飽和氯化鈉水溶液和70 mL甲醇-丙酮（3+1），高速均質提取3 min。將提取液移入離心管中，於(yu) 10000 r/min離心2 min，將上層提取液移入250 mL濃縮瓶中。殘渣每次再用50 mL甲醇-丙酮（3+1）重複提取兩(liang) 次，合並提取液。

蜂蜜、乳及乳製品樣品

準確稱取約20 g樣品（jingque至0.1 g）於(yu) 250 mL具塞錐形瓶中，加入10 mL飽和氯化鈉水溶液和70 mL甲醇-丙酮（3+1），超聲波提取30 min。移入離心管中，於(yu) 10000 r/min離心2 min，將上層提取液移入250 mL濃縮瓶中。殘渣每次再用50 mL甲醇-丙酮（3+1）重複提取兩(liang) 次，合並提取液。

2.液液分配

將提取液於(yu) 40 ℃水浴中旋轉濃縮至隻剩水相，並轉移至250 mL分液漏鬥中，加入50 mL飽和氯化鈉水溶液和25 mL乙酸乙酯，振搖3 min，靜置分層，收集乙酸乙酯相。水相再用

20 mL乙酸乙酯重複提取兩(liang) 次，合並乙酸乙酯相。經無水硫酸鈉柱脫水，收集於(yu) 250 mL濃縮瓶中，於(yu) 40 ℃水浴中旋轉濃縮至近幹，加入5 mL乙酸乙酯-環己烷（1+1）溶解殘渣，並用0.45 μm濾膜過濾，待淨化。

3.淨化

凝膠色譜（GPC）淨化

凝膠色譜淨化條件如下：

淨化柱：700 mm×25 mm，Bio Bcads S X3，或相當者；

流動相：乙酸乙酯-環己烷（1+1）；

流速：4.7 mL/min；

樣品定量環：5.0 mL；

預淋洗體(ti) 積：50 mL；

洗脫總體(ti) 積：210 mL；

開始棄去體(ti) 積：90 mL；

收集體(ti) 積：90 mL；

後棄去體(ti) 積：30 mL。

凝膠色譜淨化步驟如下：

將5 mL待淨化液按照凝膠色譜淨化條件進行淨化，合並餾份收集器中的收集液於(yu) 250 mL濃縮瓶中，於(yu) 40 ℃水浴中旋轉濃縮至近幹，加入5 mL甲醇以溶解殘渣，待淨化。

固相萃取（SPE）淨化

使用前用5 mL甲醇預淋洗C18固相萃取柱（1 g，6 mL），將5 mL溶解液傾(qing) 入C18固相萃取柱中，以1 mL/min的速度收集流出液，再用10 mL甲醇進行洗脫。收集全部洗脫液於(yu) 50 mL濃縮瓶中，於(yu) 40 ℃水浴中旋轉濃縮至幹。用甲醇溶解並定容至1.0 mL，經0.45 μm濾膜過濾後，供液質測定和確證。

國標解讀及注意事項

1.硝基咪唑標準物質用甲醇配成1000 μg/mL的標準儲(chu) 備液，在0 ～4 ℃條件下避光保存，可使用12個(ge) 月。

2.如果有條件，建議凝膠色譜淨化係統中配合使用紫外檢測器，準確監測目標化合物及雜質的流出情況。

3.固相萃取淨化過程中，C18柱作為淨化柱使用，注意上樣過程中就需要收集流出液，再和洗脫液進行合並。

4.國標方法中使用基質添加標準曲線，外標法進行回收率的校正。注意做肉類樣品的基質添加標準曲線前，先進行洗滌，然後加標，再進行後續提取淨化等流程。

5.建議使用硝基咪唑標準物質相對應的同位素內標，進行回收率的校正。

參考文獻

GB/T 21318-2007 動物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法

圖1 肌肉組織、髒器組織樣品及水產(chan) 品中硝基咪唑殘留量測定的前處理流程圖

圖2 蜂蜜、乳及乳製品樣品中硝基咪唑殘留量測定的前處理流程圖